本文是学习GB-T 32948-2016 犬科动物感染细粒棘球绦虫粪抗原的抗体夹心酶联免疫吸附试验检测技术. 而整理的学习笔记,分享出来希望更多人受益,如果存在侵权请及时联系我们
本标准规定了细粒棘球绦虫粪抗原的抗体夹心酶联免疫吸附试验(Sandwich
ELISA)检测技术
要求。
本标准适用于细粒棘球绦虫感染终末宿主(犬科动物)的诊断、检疫、效果考核及其相关流行病学
调查。
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GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法
GB19489 实验室 生物安全通用要求
下列术语和定义适用于本文件。
3.1
细粒棘球绦虫粪抗原 fecal antigen of Echinococcus
granulosus
细粒棘球绦虫寄生于犬科动物肠道，随粪便一同排出的虫体分泌物、代谢物和脱落孕节。
3.2
抗体夹心 antibody sandwich
多克隆抗体与抗原免疫结合，抗原再与单克隆抗体发生特异性结合，形成抗体-抗原-抗体“三明治”
式的复合物。
3.3
细粒棘球绦虫成虫体表抗原 the surface antigen of
Echinococcus granulosus
细粒棘球绦虫成虫经1%Triton×100作用后获得的体表抗原(EgsfAg)。
3.4
兔抗 EgsfAg 的免疫球蛋白 G the rabbit's
immunoglobulin G against EgsfAg
纯化的抗 EgsfAg 多克隆兔抗体 IgG (蛋白含量为11.12 mg/mL,
抗体滴度为1:160000以上)。
3.5
抗 EgsfAg 的鼠单克隆抗体 mouse monoclonal
antibody against EgsfAg
抗 EgsfAg 的鼠单克隆抗体(蛋白含量为14.4 mg/mL,
抗体滴度为1:80000以上)。
下列缩略语适用于本文件。
GB/T 32948—2016
OD 值 某一物质在某一个特定波长下的吸光度(optical density)
PBS 磷酸盐缓冲液(phosphate buffer solution)
PBST 含有0.05%吐温-20的磷酸盐缓冲液(phosphate-buffered saline)
TMB 四甲基乙二胺联苯胺(3,3',5,5'-tetramethylbenzidine)
EgsfAg 细粒棘球绦虫成虫体表抗原(the surface antigen of Echinococcus
granulosus)
EgsfAgRIgG 兔抗 EgsfAg 的免疫球蛋白G(the rabbit's immunoglobulin G
against EgsfAg)
EgXJ09McAb 抗 EgsfAg 的鼠单克隆抗体(mouse monoclonal antibody against
EgsfAg)
BSA 牛血清白蛋白(albumin from bovine serum)
PB 底物缓冲液(substrate buffer)
Triton X-100 聚乙二醇辛基苯基醚，非离子表面活性剂[polyethylene glycol
mono(p-1,1,3,3-
tetramethyl butyl)phenyl ether]
DMSO 二甲基亚砜(dimethyl sulfoxide)
将EgsfAgRIgG 固着在载体(PVC)
表面，并保持其免疫活性，待检抗原(犬粪便样品中 Eg 粪抗原)
与前述抗体结合，被吸附的Eg 粪抗原再与 EgXJ09McAb
特异性结合，利用兔抗鼠(IgG) 二抗 HRP 与
前述被捕捉的单克隆抗体特异性结合，携带的酶催化底物显色。底物转化为有色产物的量与酶量及待
检样品中抗原量成正比，故可根据颜色反应的深浅来定性或定量分析待检样品阴、阳性。阴性样品说明
该被检终末宿主没有感染细粒棘球绦虫；阳性样品说明被检宿主感染了细粒棘球绦虫。
本标准试剂除特殊规定外，均指分析纯试剂。
PBS (见附录 A): 常温保存。
PBST (见附录 A): 常温保存。
包被液(pH=9.6):Na₂CO₃0.16 g,NaHCO₃0.29g,H₂O100 mL,4℃保存。
封闭液：脱脂奶粉5 g,PBS 100 mL,4 ℃保存。
EgsfAgRIgG:-20℃ 保存。
EgXJ09McAb:-70 ℃保存。
兔抗鼠(IgG) 二抗 HRP:-20 ℃保存。
TMB 底物缓冲液(见附录 A):4 ℃保存。
TMB 底物显色剂(见附录 A):4 ℃保存。
TMB 底物显色液(见附录 A):4℃ 保存。
终止液：浓 H₂SO₄10 mL,H₂O80 mL,常温保存。
1%BSA:BSA 1 g,PBS100 mL,4℃保存。
96孔酶标反应板： -20℃。
低温台式高速离心机：要求最大离心力在12000 g 以上。含有450 nm
波长的酶标仪。37 ℃恒温 培养箱。振荡混匀器。电子天平(精确度：0.01
g)。2℃~4℃ 冰箱、 -20℃冰柜和-70℃超低温
冰箱。
GB/T 32948—2016
可调移液器一套，12道微量移液器(50μL～300μL), 与移液器配套的吸头。50 mL
塑料离心管、
记号笔、塑料自封带、竹签、 一次性手套、口罩、帽子、胶鞋、连体防护服等。
用无菌竹签收集尽可能新鲜的犬粪便2 g～3g, 装入50 mL
离心管内，编号，登记。用塑料自封袋
将其封闭后，置于加冰的保温箱中，冷冻运至实验室；保存一20℃以下，待检。
将犬粪样置-70℃,低温冷冻至少1周，以灭活病原。室温解冻，粪样加等量PBST
(按质量比),充 分溶解混匀，静置30 min,4000g, 离心15
min,上清液即可用于检测。该上清液可在2℃~8℃条件
下保存1周；若需长期保存，应分装放在一20℃以下冰柜内，避免反复冻融。
采样和处理过程中样本不得交叉污染，采样及样品处理过程中应注意安全防护，应戴一次性手套、
口罩、帽子，穿胶鞋(或鞋套)和连体防护服等。
将适宜浓度的 EgsfAgRIgG(5μg/mL)
包被96孔酶标反应板，100μL/孔，反应板盖严，并在4℃
下孵育过夜。
用PBST 洗涤3次，每次加入洗液后放置1
min;倒出后拍打干净。加入封闭液，200μL/孔，反应板
37℃湿盒孵育1 h。
用 PBST 洗涤3次，每次加入洗液后放置1 min;倒出后拍打干净。 A1、A2
孔加入样品稀释液， 100μL/孔；B1、B2至 E1、E2孔加入标准阴性抗原 N1～N4
(见附录 A),100μL/ 孔；F1、F2 孔加入标准 阳性抗原P (见附录A),100μL/
孔；其余孔先加入PBST 80μL/孔，然后加入检测样本上清，20μL/孔，
混匀，每个检测样品加2孔(建议加样参照附录C 示意图),37℃湿盒密闭孵育30
min。 按加样顺序应
详细记录检测样本信息(包括编号、日期等)。
用 PBST 洗 涤 3 次，每次加入洗液后放置1 min;
倒出后拍打干净。除空白孔外，加入
EgXJO9McAb (建议工作滴度为1:4000～1:6000),100μL/孔，37℃湿盒密闭孵育30
min。
用 PBST 洗涤3次，每次加入洗液后放置1
min;倒出后拍打干净。除空白孔外，加兔抗鼠(IgG) 二
抗 HRP,100μL/ 孔，37℃湿盒密闭孵育30 min。
GB/T 32948—2016
用 PBST 洗涤3次，每次加入洗液后放置1 min;倒出后拍打干净。加入TMB
底物显色液100μL/
孔，37℃避光孵育15 min。
加入终止液50μL/孔，10 min 内读取450 nm 的 OD
值，并计算空白孔、阳性孔、阴性孔和检测样品
孔的平均 OD 值。
当 ELISA 反应结束并加入终止液后10 min 内用酶标仪测量各孔在450 nm
波长时的光吸收值 (OD 值)。并计算空白孔、标准阳性孔和每个标准阴性孔的 OD
平均值(N1、N2、N3、N4)。 要求空白 孔的OD 平均值\<标准阴性孔的OD
平均值\<标准阳性孔的OD 平均值；标准阳性OD 平均值(P) 与所 有标准阴性 OD
平均值(N) 之比大于或等于2.1(即P/N≥2.1), 否则检查ELISA 板是否合格，加样位
置是否有错误等。
计算待测样品 OD 平均值和标准阴性 OD 值平均之比。当待测样品 OD 平均值(P)
与所有标准阴 性 OD 平均值(N) 之比大于或等于2.1(即P/N≥2.1)
时，定该待测样品为阳性，表示其含细粒棘球绦
虫成虫抗原。
(规范性附录)
相关试剂的配制
A.1 PBS(pH=7.2)
NaCl4 g,KC10. 1 g,Na2HPO₄0.72g,KH₂PO₄0. 12 g,H₂O500
A.2 PBST(pH=7.2)
NaCl4 g,KCl0.1g,Na₂HPO₄0.72g,KH₂PO₄0.12g,H₂O500
A.3 TMB 底物缓冲液 (pH=6)
GB/T 32948—2016
mL。
mL,吐温-200.25 mL。
A 液 ：NaH₂PO₃ ·H₂O27.6g,H₂O1L。
B 液 ：Na₂HPO₃ ·2H₂O35.6 g,H₂O1L。
A 液87.7 mL+B 液12.3 mL。
A.4 TMB 底物显色剂
DMSO 10 mL TMB粉60 mg
A.5 TMB 底物显色液(临用前配制)
TMB 底物缓冲液10 mL
TMB 显色剂100μL
H₂O₂15μL
A.6 标准阴性抗原 N1～N4
在实验室对实验犬用吡喹酮(5 mg/kg) 和丙硫咪唑(20 mg/kg)
联合驱虫，1周后镜检无虫卵，其粪
便 按 照 粪 抗 原 制 备 方 法 ， 即 可 作 为 标 准 阴 性 抗 原 N ( 蛋 白
含 量 平 均 约 为 0 . 0 3 2 mg/mL~
A.7 标准阳性抗原 P
在实验室人工感染细粒棘球绦虫实验犬获得的粪便样品，经虫卵灭活处理(一70℃,低温冷冻至少
1周)后，按照粪抗原的制备方法，上清液即可作为标准阳性抗原P
(蛋白含量平均约为0.033 mg/mL)。
GB/T 32948—2016
(规范性附录)
检测过程中生物安全和防止交叉污染的措施
B.1 实验室设备要求
B.1.1 实验室共分为两个独立的工作区域：样品处理区，ELISA
检测区，各区应有明确标识。
B.1.2 各区应有专用的仪器、设备，标识明确。
B.1.3 各区应使用单独颜色或有明显区别标识的工作服，只准在本区穿着。
B.1.4 各区应有各自的清洁用具以防止交叉污染。
B.2 工作区域仪器设备配置
B.2.1 样品处理区仪器设备配置
2℃~8℃冰箱； -20℃冰箱； 一70℃超低温冰箱；台式离心机(≥12000 r/min);
混匀器；电子天
平(精度：0.01 g); 微量加样器(20μL～200μL,200μL～1000μL); 可移动紫外灯。
B.2.2 ELISA 检测区仪器设备配置
恒温培养箱，混匀器，2℃~8℃冰箱，微量加样器(0.5μL～10μL,5μL～20μL,20μL～200μL,
200μL～1000μL,12 道 2 0 μL～300μL), 全波长酶标仪，或有450 nm
波长酶标仪，可移动紫外灯，电
脑，打印机。
B.3 各工作区域功能及注意事项
B.3.1 样品处理区
B.3.1.1 样品处理、保存，酶标板上样均在样品处理区进行。
B.3.1.2
用过的加样器吸头应放入专门的消毒(例如含次氯酸钠溶液)容器内。实验室桌椅表面每次
工作后都要清洁，实验材料(原始粪样、处理过程中样品与试剂的混合液等)如出现外溅，应消毒处理，并
作出记录。
B.3.1.3
在本区开展实验时，操作者应穿一次性防护服、鞋套，戴一次性手套和帽子。工作结束后应立
即对工作区进行消毒，所有废弃物品都应做高压处理，方可丢弃。本工作区的实验台表面应耐受诸如次
氯酸钠等的化学物质的消毒清洁作用。
B.3.2 ELISA 检测区
B.3.2.1
在进行试验的过程当中，稀释溶液所使用的容器应保证洁净无污染。
B.3.2.2 每一步的洗涤要彻底，避免影响最后的显色读值。
GB/T 32948—2016
(规范性附录)
酶标板检测样品加样示意图
酶标板检测样品加样示意图见图 C.1。
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注： 空白孔没包被，留作本底；
凡无特殊指出的孔，均可作为待检样品孔，待检样品加双孔。
图 C.1 酶标板检测样品加样示意图
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